Séquences génomiques de Tropheus moorii et Petrochromis trewavasae , deux poissons cichlidés écomorphologiquement divergents endémiques du lac Tanganyika - Publié : 22 février 2021

• C. Fischer , S. Koblmüller , C. Börger , G. Michelitsch , S. Trajanoski , C. Schlötterer , C. Guelly , GG Thallinger & C. Sturmbauer

Avec un âge de 9 à 12 millions d'années (ma) 5 , 6 , le lac Tanganyika est de loin le plus ancien de ces lacs. En raison de son âge ancien, l'assemblage d'espèces du lac Tanganyika est à un stade de maturité, de sorte qu'il comprend la plus grande diversité génétique et phénotypique parmi les radiations de cichlidés d'Afrique de l'Est, mais la diversification ultérieure se déroule principalement sans grande innovation éco-morphologique 2 . Lors de la colonisation du lac émergent, les cichlidés ont profité de la fenêtre d'opportunité écologique et se sont rapidement diversifiés 4 . En fait, deux lignées colonisatrices ont subi une hybridation au tout début de la radiation, un événement qui pourrait avoir déclenché ou accéléré le début 6 . La radiation du lac Tanganyika occupe une position clé pour l'ensemble de la faune de cichlidés africains modernes, dans la mesure où trois des lignées lacustres nouvellement émergentes ont réussi à coloniser les rivières environnantes, de sorte que la radiation a balayé à plusieurs reprises les limites du lac en maturation 7 , 8 , 9 , 10 . Français Trois des lignées émergentes, les Lamprologini non incubateurs buccaux, les Orthochromini incubateurs buccaux et certains Haplochromini primitifs tels que les ancêtres des genres Pseudocrenilabrus et Serranochromis , ont quitté le lac à divers stades de maturation pour coloniser des plans d'eau environnants particuliers 7 , 8 , 9 , 11 , 12 , 13 . Un groupe d'haplochromines primitifs a continué d'évoluer dans l'interface lac-marais-rivière vers des incubateurs buccaux maternels plus élaborés, délimités par un dimorphisme sexuel accru et des taches d'œufs sur la nageoire anale 6 , 9 , les haplochromines dites modernes. Ces haplochromines modernes ont non seulement colonisé la plupart des systèmes fluviaux dans toute l'Afrique australe et orientale, mais sont également réintégrés dans l'écosystème du lac Tanganyika, déjà beaucoup plus profond et mature, pour évoluer vers la tribu endémique du lac Tanganyika Tropheini 9 , 14 . Ainsi, les Tropheini ont réussi à s'introduire dans une radiation lacustre en cours et déjà complexe, tandis que ses sœurs non lacustres se sont répandues dans plusieurs systèmes fluviaux pour ensemencer des radiations dans les lacs émergents le long de leurs voies de dispersion fluviale 6 , 8 , 9 , 15 , 16 .

La tribu Tropheini, endémique du lac Tanganyika, représente le groupe frère de tous les haplochromines modernes en dehors du lac et en a divergé il y a environ 3 à 9 millions d'années 6 . Le fait que cinq des 29 espèces de Tropheini soient présentes à la fois dans le lac lui-même et en amont dans les rivières affluentes et/ou dans certaines parties de la rivière Lukuga, le seul exutoire du lac, pourrait être dû à leur origine marécageuse 17 . C'est pourquoi nous avons décidé de séquencer et de comparer les génomes de deux espèces écologiquement divergentes de la tribu Tropheini, endémique du lac Tanganyika. En termes de génétique, les haplochromines modernes, y compris les Tropheini, sont emblématiques car leurs génomes généralistes adaptés aux rivières ont subi à plusieurs reprises des modifications adaptatives récurrentes lors d'opportunités écologiques, fournies par les lacs nouvellement émergents 4 . Français Il a été suggéré que les espèces écologiquement et phénotypiquement flexibles adaptées aux habitats fluviaux saisonnièrement instables peuvent supplanter les autres colonisateurs dans l'ensemencement des radiations lacustres, car elles peuvent rapidement s'adapter à un espace de niche vide via la plasticité phénotypique 18 . Selon l'hypothèse de la tige flexible, une population phénotypiquement plastique est subdivisée en phénotypes adaptatifs alternatifs et ensuite les facteurs génétiques adaptatifs sont triés pendant la spéciation pour progresser via l'accommodation génétique et l'assimilation génétique. Au cours de la divergence adaptative pendant les radiations adaptatives répétées, l'évolution génomique a probablement été façonnée par l'opportunité écologique, en combinaison avec des événements de fragmentation géographique, des épisodes de goulots d'étranglement et des expansions de population, ainsi que des mélanges ou des fusions répétés dans les événements d'hybridation causés par les fluctuations du niveau des lacs induites par le climat 4 , 19 . Outre la divergence et le flux génétique accidentel 6 , 20 , la duplication et la sélection géniques 6 , 21 ont apparemment remodelé les génotypes. Français Au niveau phénotypique, le succès évolutif des cichlidés d'Afrique de l'Est a été attribué à des innovations clés particulières, notamment (1) le découplage fonctionnel des mâchoires orales et pharyngiennes facilitant l'exploitation de diverses niches trophiques 22 , (2) l'adaptation du système visuel à différentes turbidités de l'eau 23 , et (3) les soins parentaux et la coloration d'accouplement des mâles dictés par la sélection sexuelle facilitant l'isolement reproductif 24 . À ce stade, la série de mécanismes génétiques modifiant le substrat génomique sous-jacent à l'énorme éco-morphospace phénotypique couvert par les cichlidés reste largement inconnue (voir 25 pour une revue récente).

Les premières étapes importantes vers la compréhension des mécanismes moléculaires à l'origine de ces morphologies divergentes ont été franchies en élucidant les génomes et les transcriptomes de cinq espèces de cichlidés : Oreochromis niloticus représentant une lignée externe, Neolamprologus pulcher représentant une lignée de reproducteurs sur substrat du Tanganyika, et trois haplochromines modernes, à savoir Astatotilapia burtoni représentant une lignée fluviatile, Maylandia zebra représentant le lac Malawi et Pundamilia nyererei représentant le lac Victoria. Cette étude a mis en évidence un excès de duplications de gènes dans la lignée est-africaine par rapport à Oreochromis et d'autres téléostéens, une abondance de divergence d'éléments non codants, une évolution accélérée des séquences codantes, une divergence d'expression ainsi que des insertions d'éléments transposables et une régulation par de nouveaux microARN 21 . L'étude a également révélé une sélection diversifiante à l'échelle du génome sur les variantes codantes et régulatrices, dont certaines provenaient d'anciens polymorphismes.

Des ébauches de génomes de haute qualité (HQ) basées sur les données de Pacific Biosciences (PacBio) sont devenues disponibles en particulier au cours des deux dernières années. Des ébauches HQ de Simochromis diagramma (Afrique de l'Est, lac Tanganyika) et d'Astatotilapia calliptera (Afrique de l'Est, lac Malawi) ont été générées par l'Institut Sanger (2018) et une ébauche HQ d' Archocentrus centrarchus (Amérique centrale) a été générée par le groupe G10K-VGP (2019) ; des assemblages des cichlidés sud-américains Amphilophus citrinellus (2014, Université de Constance) et Andinoacara coeruleopunctatus (2015, Institut Sanger) 26 sont également disponibles. Les génomes d'O. niloticus (ON) et de M. zebra (MZ) ont récemment (2019) été nouvellement assemblés et ancrés avec une approche PacBio + carte génétique à haute couverture 27 ; Français les génomes de A. calliptera, A. centrarchus et S. diagramma (non ancré) ont été reconstruits de manière similaire. Oreochromis niloticus, M. zebra , A. calliptera et A. centrarchus sont les seules reconstructions au niveau chromosomique (groupes de liaison). Sept brouillons HQ ont reçu des annotations du NCBI Annotation Pipeline 28 ( S. diagramma pas encore) ; O. niloticus, A. calliptera et A. citrinellus ont également reçu des annotations d'Ensemble 29. Ces génomes couvrent des espèces des Grands Lacs et des rivières d'Afrique et des lacs de cratère d'Amérique centrale et d'Amérique du Sud (Fig. 1 ).

Généralement, les assemblages sont basés sur les données génomiques d'un seul individu, idéalement issu d'une lignée consanguine. Dans ce projet, nous avons assemblé à partir de 6 (PT) et 5 (TM) individus non consanguins, respectivement ; cela a nécessité une approche d'assemblage plus complexe. De plus, nous avons réalisé un séquençage de novo sans aucune donnée de liaison ni de carte optique (comme le montrent les dernières versions du génome d' O. niloticus et d'A. calliptera ) et la couverture PacBio était (avec environ 9–10 ×) considérablement inférieure à celle utilisée pour les assemblages d' O. niloticus (44 × pour v3 30 et v4 27 ) et de M. zebra (16,5 × pour v3 40 , ajouté aux couvertures PE et MP d'Illumina déjà élevées, et 65 × pour v4 27 ). Français Néanmoins, les deux assemblages se comparent bien aux versions préliminaires du génome publiées d'espèces comparables en ce qui concerne les mesures typiques concernant le contenu génétique. Les résultats BUSCO (Tableau 5 ) montrent un faible taux d'environ 4 à 8 % (selon la base de données) de BUSCO dupliqués dans PT et TM. Ce taux est légèrement supérieur aux environ 2 à 4 % rapportés pour d'autres génomes de cichlidés, ce qui peut être une conséquence d'un assemblage incorrect d'haplotypes provenant d'individus non consanguins. En ce qui concerne le nombre total de BUSCO identifiés, les BUSCO fragmentés et manquants, la reconstruction du génome PT et TM fonctionne très bien.

Pour les deux espèces, les annotations se sont avérées valides pour les premières analyses en aval pertinentes, mais certains modèles génétiques pourraient nécessiter des améliorations supplémentaires, par exemple par l'entraînement répété des prédicteurs génétiques ; cependant, pour AUGUSTUS, le prédicteur central, les évaluations du modèle montrent déjà de bons états d'entraînement (voir le tableau supplémentaire S12 ). Les sources les plus pertinentes de modèles génétiques insuffisants pourraient inclure les fusions, les divisions et surtout les troncatures de gènes, qui sont évidentes après une inspection plus approfondie ; ceci est typique des annotations précoces, en particulier lorsque le pipeline d'annotation est encore en cours de développement. Nous observons une longueur moyenne et médiane relativement faible des séquences protéiques (voir le tableau 2 ) dans les deux assemblages/annotations. Cela pourrait refléter une erreur systématique dans le processus de génération, par exemple des InDels conduisant à des décalages de cadre et, par conséquent, à des traductions erronées et à des codons stop prématurés. L'étude de ce phénomène a montré des InDels non triplets ; cependant, on les retrouve également entre, par exemple, les modèles de transcription d'O. niloticus et de M. zebra . Français De plus, le taux de mutations non-sens identifiées dans PT et TM est faible (Tableau 9 ). Les pipelines d'annotation NCBI et Ensembl sont à la pointe de la technologie ; de plus, la quantité et la diversité des données de séquençage d'ARN utilisées pour l'annotation, par exemple, d'O. niloticus étaient bien plus importantes que pour l'une ou l'autre espèce dans ce projet. Par conséquent, le plus grand nombre d'isoformes de transcription identifiées (ainsi que le nombre moyen plus élevé d'exons par transcription) peuvent être considérés comme des conséquences directes. Cependant, le nombre total d'exons dans les deux espèces est comparable aux annotations ON. Il est intéressant de noter que le nombre de modèles génétiques dans PT et TM est également comparable à celui d'ON v3. Comme il n'existe pas de méthode bien établie pour évaluer l' exactitude des modèles génétiques (peut-être par une vérification de structure générale et un score majoritaire de similarité basé sur une base de données), il s'agit simplement d'une comparaison du nombre d'éléments. De plus, comme mentionné précédemment, il existe des fusions et des divisions génétiques dans les modèles génétiques PT et TM, ce qui fausse le nombre de gènes dans une certaine mesure. DOGMA 36 et PfamScan 41 ont également été utilisés comme mesure de la qualité des gènes codant pour des protéines annotées ; les résultats corroborent l'hypothèse de modèles génétiques défectueux dans cet ensemble, qui ne contiennent pas certains domaines protéiques ou seulement des fragments de ceux-ci (tableau 7 ).

L'analyse comparative présentée ici a produit, comme prévu, un grand nombre de régions variantes entre les deux espèces et même une quantité considérable au sein de chaque espèce. La grande quantité de variation au niveau intraspécifique peut en fait être due à notre approche consistant à utiliser plusieurs individus F1 non consanguins d'une seule population échantillonnée dans l'environnement naturel, mais reflète mieux la diversité intrapopulation et finalement l'âge évolutif ancien de la lignée. Nous avons utilisé GATK 42 et DELLY 43 , deux outils bien établis, pour l'appel de variantes ; cependant, l'appel de variantes n'est pas encore un problème bien résolu avec souvent peu de chevauchement entre les résultats des différentes routes algorithmiques (par exemple, voir 44 , 45 ). Quant aux statistiques rapportées sur les effets des variantes, il est connu que l'état de l'annotation structurelle et l'annotateur d'effet de variante utilisé influencent fortement les résultats 46 . Les résultats d'analyse présentés ici reflètent l'état des reconstructions du génome (v1).

Le nombre relativement important de SV et SMV réciproquement triés parmi les deux espèces étudiées est remarquable et pourrait refléter le temps de divergence relativement ancien entre les deux espèces étudiées s'élevant à environ 2,5 à 6 millions d'années pour les deux clades 6 . En fait, on s'attend à ce que les mutations structurelles affectant l'information de codage aient besoin de plus de temps pour évoluer que les mutations régulatrices. Ainsi, en comparant les espèces des lacs Victoria et Malawi, beaucoup plus récents, on ne s'attendrait pas à un degré aussi marqué de variation de codage réciproquement distincte. Le SV et le SMV peuvent également être interprétés à la lumière de l'hypothèse de la tige flexible 4 , 18 . La tige flexible des radiations de cichlidés est formée d'espèces écologiquement et phénotypiquement flexibles adaptées aux habitats fluviaux saisonnièrement instables. Une fois qu'elles ensemencent les radiations lacustres, elles peuvent rapidement s'adapter à un espace de niche vide dans cet environnement plus stable en raison de leur grande portée de plasticité phénotypique 18 . Par la suite, la population phénotypiquement plastique est subdivisée en phénotypes adaptatifs alternatifs, puis les facteurs génétiques adaptatifs sont triés lors de la spéciation pour progresser par accommodation génétique et assimilation génétique 47 . La plasticité phénotypique ou développementale fait référence à la capacité d'un seul génotype à produire de multiples phénotypes dans différentes conditions environnementales. L'hypothèse de la tige flexible postule que la plasticité d'une population peut influencer la direction de l'évolution en exposant une variation génétique cryptique à la sélection dans un nouvel environnement. Selon ce modèle, des sous-ensembles d'une population ancestrale exploitent des niches écologiques distinctes dans un nouvel habitat, comme différents types d'aliments. Au cours d'une seule génération, la plasticité anatomique peut conduire à une augmentation de la fitness, par exemple une capture ou une transformation plus efficace des aliments, dans chaque niche. La variation phénotypique nouvellement exposée sera ciblée par la sélection, et si le nouvel environnement est stable, les phénotypes plastiques peuvent être canalisés par assimilation génétique. Français L'hypothèse est que les mécanismes moléculaires de la réponse plastique sous-tendent également l'évolution des phénotypes clés, c'est-à-dire que la variation génétique dans les mêmes molécules/voies de signalisation, qui permettent la plasticité, est ciblée par sélection et fixée afin de canaliser le phénotype. Dans une étude récente, le rôle de la signalisation hedgehog (Hh) dans la plasticité cranio-faciale chez les téléostéens a été mis en évidence, démontrant que les niveaux de Hh ajustent la sensibilité aux signaux mécaniques liés aux conditions de recherche de nourriture – où les changements morphologiques adaptatifs dans les structures immédiatement affectées, par exemple, les os pharyngés, peuvent propager des changements morphologiques à d'autres structures cranio-faciales 48 .

Des variants ont été appelés dans pratiquement toutes les régions génétiques. Environ 99 % ont au moins un variant possible dans le corps du gène ou 5 kb en amont/en aval, selon les paramètres appliqués (Fig. 3 B). Les gènes présentant au moins une mutation ont été soumis à une analyse d'ontologie génétique (GO) afin d'obtenir des indices sur d'éventuels groupes fonctionnels intéressants affectés par davantage de variants. Autrement dit, le nombre de variants (ou « charge mutationnelle ») a été utilisé comme indicateur de la probabilité de changements effectifs. La justification de cette approche était l'hypothèse de l'exactitude du modèle infinitésimal ou du modèle omnigénique 49 , respectivement. On peut s'attendre à ce que les changements phénotypiques observés ne soient pas dus à quelques variants à fort impact (généralement dans la région codante), mais plutôt à plusieurs variants à « faible impact » (dans les catégories utilisées, probablement les " variants modificateurs " qui représentent généralement > 90 % de la charge mutationnelle). Français Même si à ce stade la pertinence de la variation dans les gènes sélectionnés n'est pas claire, tous les gènes listés ont de multiples appels concernant SMV et SV (Fig. 3 B) ce qui peut augmenter les chances d'influences efficaces sur les phénotypes. Étant donné les fonctions qui leur sont assignées rapportées dans d'autres organismes (Tableau 10 ), cependant, ces gènes méritent d'être sondés. Par exemple, cinq gènes liés à la définition de la forme du nez et du menton ( DCHS2 , RUNX2 , GLI3 , PAX1 et EDAR ) ont récemment été identifiés dans une étude GWAS humaine 50 ; plusieurs variants dans tous ces gènes ont également été trouvés entre les deux espèces. De plus, PAX3 , KCTD15 et les membres de la famille TBX ( TBX1 et TBX10 , mais pas TBX15 comme rapporté précédemment) sont dans l'ensemble des résultats ; ces gènes ont été liés à la morphologie faciale chez l'homme dans deux autres études GWAS récentes 51 , 52 (Tableau 10 ). Les futures analyses en aval devraient se concentrer en particulier sur les gènes présentant des différences d'expression stables entre les espèces étudiées. Comme indiqué précédemment, nous nous concentrons sur les différences de formes faciales et pharyngées (voir figure supplémentaire S1 ).). Il est intéressant de noter que cette méthode simple de comptage de variants non biaisés (« charge de mutation ») génère de manière reproductible les termes GO liés à la morphogenèse du viscérocrâne (voir Informations supplémentaires), sans donner une longue liste de termes GO plutôt peu spécifique. Le résultat GO met en évidence plusieurs voies de signalisation importantes : la signalisation BMP (par exemple, bmp2, bmp4), la signalisation Hedgehog (Hh) (par exemple, Shh, famille Gli, famille Sec, smo, med12, plcb3), la signalisation de l'endothéline (par exemple, edn1, furine, famille dlx), la signalisation de l'acide rétinoïque (RA) (par exemple, rere, rerea) et la signalisation du facteur de croissance des fibroblastes (FGF) (par exemple, fgf8, fgf20b) (voir Tableau 10 et Tableau supplémentaire S21 ). Tous ces réseaux de signalisation sont connus pour jouer un rôle dans la régulation de la morphogenèse faciale des vertébrés, et ils interagissent. Il existe, par exemple, de fortes interactions coopératives et fonctionnelles entre Shh et l'acide rétinoïque 53 , 54 , 55 , 56 , 57 , 58 . Une analyse comparative plus approfondie de la distribution des variantes génétiques observées entre les deux espèces et leurs phénotypes respectifs n'a pas été réalisée à ce stade ; ce sera une tâche importante pour les études de suivi.

En résumé, les deux nouveaux génomes préliminaires ajoutent deux espèces clés monophylétiques et écomorphologiquement divergentes, comblant ainsi une importante lacune phylogénétique. De plus, elles représentent la première ramification des cichlidés haplochromines modernes, la lignée la plus riche en espèces de cichlidés d'Afrique de l'Est. Alors que les Tropheini rayonnaient dans les limites du lac Tanganyika, leurs alliés se sont répandus sur plusieurs rivières, ensemençant des radiations supplémentaires, comme celles des lacs Malawi et Victoria, où celles-ci ont atteint une diversité écomorphologique comparable.

Les méthodes de laboratoire (extraction d'ADN, préparation de la banque et séquençage) ont, en partie, été décrites précédemment dans l'article d'accompagnement sur les génomes mitochondriaux 59 . De plus, nous avons effectué deux séquençages en utilisant la technologie de séquençage de deuxième génération de Pacific Biosciences basée sur un individu par espèce. L'extraction d'ADN a été réalisée à Graz, la préparation de la banque et le séquençage au Lausanne Genomic Technologies Facility : l'ADN a été cisaillé dans un Covaris g-TUBE (Covaris, Woburn, MA, États-Unis) pour obtenir des fragments de 20 kbp. Après cisaillage, la distribution de taille de l'ADN a été vérifiée sur un analyseur de fragments (Advanced Analytical Technologies, Ames, IA, États-Unis). 5 μg de l'ADN cisaillé ont été utilisés pour préparer une banque SMRTbell avec le PacBio SMRTbell Template Prep Kit 1 (Pacific Biosciences, Menlo Park, CA, États-Unis) selon les recommandations du fabricant. La banque obtenue a été sélectionnée par taille sur un système BluePippin (Sage Science, Inc. ; Beverly, MA, États-Unis) pour les molécules supérieures à 11 kbp. La banque récupérée a été séquencée sur treize/seize cellules SMRT (TM/PT) avec la chimie P6/C4 et des MagBeads sur un système PacBio RSII (Pacific Biosciences, Menlo Park, CA, États-Unis) à une durée de 240 minutes.

Pour l'ARN-seq, l'ARN total d'un individu mâle et femelle par espèce (regroupés à partir des tissus suivants : foie, rate, cerveau, cœur et muscle squelettique) a été extrait avec Trizol comme suit : le tissu a été homogénéisé avec MagnaLyser et incubé avec un tube Trizol 5 min à température ambiante (TA) ; 200 µl de chloroforme (/ml de Trizol) ont été ajoutés et agités vigoureusement pendant 15 s, incubés pendant 2 à 3 min/TA et centrifugés à 12 200 tr/min/4 °C/15 min ; le surnageant a été transféré dans un nouveau tube de 1,5 ml et 500 µl d'isopropanol (/ml de Trizol) ont été ajoutés ; après vortexage, incubation pendant 10 min/TA, centrifugation à 12 200 tr/min/4 °C/10 min, le surnageant a été jeté et le culot placé sur de la glace immédiatement. Les culots ont été lavés deux fois : ajouter 1 ml d’EtOH 80 % (–20 °C), centrifuger à pleine vitesse/4 °C/5 min, éliminer le surnageant et enfin sécher à 37 °C. Les culots séchés ont été remis en suspension dans 20 µl d’eau distillée. Les banques d’ARN-seq ont été dérivées de l’ARN total, appauvri en ARNr, normalisé et séquencé sur une seule voie Illumina HiSeq 2500 par espèce.

FastQC v0.10.1 60 a été utilisé pour l'évaluation de base de la qualité de lecture. Une approche personnalisée basée sur le spectre k-mer utilisant JELLYFISH v2.0 61 (en conjonction avec une base de données de séquences techniques connues) et une approche basée sur De Bruijn (implémentée dans Minion à partir du package Kraken v13-274 62 ) ont été utilisées pour l'identification automatique des contaminants techniques et des séquences suspectes (sur la base des fréquences attendues). De plus, FastQScreen v0.4.4 63 a été utilisé pour l'identification spécifique à l'espèce de la contamination biologique et DeconSeq v0.4.3 64 pour son élimination. Cutadapt v1.5 65 a été utilisé pour la suppression des contaminants techniques, Scythe v0.994 66 pour un ajustement supplémentaire de l'adaptateur 3', CLC quality trim v4.2 67 pour un ajustement de lecture basé sur le score de qualité et Reaper v13-274 62 pour un filtrage supplémentaire basé sur la qualité et la complexité. BBmerge v33.40 68 a été utilisé pour la fusion des lectures appariées superposées et FastUniq v1.1 69 pour la suppression des doublons. Nextclip v1.2 70 a été utilisé pour le filtrage et la classification des lectures par paires mates Nextera. 454 ensembles de données ont également été filtrés avec sffToCA (utilitaire Celera Assembler). Français BAMtools v2.4.0 71 , SAMtools/BCFtools/HTSlib v1.4 72 et les outils Picard v1.119 73 ont été utilisés pour la cartographie et les manipulations de fichiers de séquences telles que l'indexation, la fusion, le tri et la génération de sous-ensembles, la suppression des lectures en double et la suppression de la contamination PE des bibliothèques MP dans les fichiers de séquences. Proovread v2.13.10 74 a été utilisé pour la correction de lecture PacBio en utilisant toutes les données PE Illumina disponibles et les unités créées par MaSuRCA v2.3.2 75 . SEECER v0.1.3 76 et Rcorrector v1.0.2 77 ont été utilisés pour le RNA-seq et Musket v1.1 78 pour la correction des bases-calls du DNA-seq. Les ensembles de données DNA-seq et RNA-seq ont été prétraités en utilisant le même pipeline (avec des paramètres différents) ; en général, deux régimes de filtrage ont été appliqués à chaque ensemble de données (« strict »/« standard » et « détendu ») en prévision de différents cas d'utilisation en aval (voir le tableau supplémentaire S22 ). Les tailles des génomes ont été estimées par une approche basée sur le spectre k-mer implémentée dans GCE v1.0.2 79 .

L'annotation structurelle des gènes codants et des ARNt a été générée à l'aide des pipelines MAKER v3.0 107 (en utilisant les détecteurs de gènes GeneMark-ES v4.32 109 , AUGUSTUS v3.2.1 100 , SNAP v2013-11–29 110 et tRNAscan v1.3.1 111 ), Funannotate v0.5.5-v0.7.0 112 (FA) et BRAKER1 v1.9 113 (en utilisant GeneMark-ET v4.32 114 et AUGUSTUS v3.2.1 100 ) ; BRAKER1 a également été utilisé pour l'entraînement AUGUSTUS. De plus, des modèles de gènes ont été créés avec StringTie v1.3.2d 115 et Cufflinks v2.2.1 116 .
Tous les modèles ont été combinés par EVidenceModeler v1.1.1 117 (EVM) sous le contrôle de MAKER3. Pour les ARN non codants, Infernal v1.1.2 118 , Rfam v12.1 119 et FEELnc v0.1.0 120 ont été utilisés. L'ensemble d'entraînement d'ARNm pour FEELnc a été dérivé des données d'annotation FA/MAKER, où des modèles génétiques présumés « bons » avec une structure similaire aux modèles précédemment publiés ont été sélectionnés ; l'ensemble d'entraînement d'ARNlnc a été généré par mélange des séquences d'ARNm. Les microsatellites ont été appelés avec MISA v1.0 121 , les îlots CpG avec EMBOSS v6.6.0 122 cpgplot et les ORFs avec EMBOSS v6.6.0 getorf (et post-traitement R). Les répétitions ont été déterminées à l'aide de RepeatMasker v4.0.6 32 (avec RepBase v20160321 123 et des bibliothèques spécifiques aux espèces générées avec RepeatModeler v1.0.8 124 ), RepeatScout v1.0.5 125 et TRF v406 126 .

L'annotation fonctionnelle a été réalisée à l'aide d'InterProScan v5.24–63.0 127 (en utilisant les bases de données CDD-3.14, Coils-2.2.1, Gene3D-3.5.0, Hamap-201605.11, MobiDBLite-1.0, PANTHER-11.1, Pfam-30.0, PIRSF-3.01, PRINTS-42.0, ProDom-2006.1, ProSitePatterns-20.119, ProSiteProfiles-20.119, SFLD-2, SMART-7.1, SUPERFAMILY-1.75, TIGRFAM-15.0 et TMHMM-2.0c). De plus, sous le contrôle de FA, les bases de données eggNOG v4.5.1 128 (fiNOG), MEROPS v12.0 129 , dbCAN v5.0 130 et BUSCO vertebrata v3 34 ont été utilisées pour les recherches de similarité et SIGNALP v4.1 131 pour l'identification des séquences de signaux de localisation des cibles.

L'intégration finale de toutes les annotations a été réalisée avec R 3.4.3/Bioconductor 3.6 en utilisant les packages data.table 1.12.2, GenomicFeatures 1.30.3, VariantAnnotation 1.24.5 et leurs dépendances.

© mic.mag 2015 - tous droits réservés - All right reserved ©